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        高效率低成本的GMP轉染方案,解決細胞和基因治療生產中的關鍵問題!

        病毒載體技術的進步提高了基因和細胞治療的安全性和有效性,全球已有多種基因和細胞治療藥物被監管機構批準上市。目前大多數基因/細胞治療方法都是利用病毒載體來實現的,其中最常用的兩種病毒載體——腺相關病毒(AAV)載體常被用于基因治療,而慢病毒(LV)載體則常被用于基因修飾細胞治療。病毒載體通常是2-4質粒共轉入HEK293細胞生產出的,而轉染試劑是病毒載體生產的關鍵要素之一,對轉染效率和功能效價有顯著影響。第一代非病毒轉染方法依靠簡單的線性聚合物,如聚乙烯亞胺(PEI)或脂質體將DNA轉入到細胞內,但其性能并不能完全滿足病毒載體的大規模生產需求。雖然人工合成轉染試劑在過去30年里取得了巨大的進步,但仍然難以逾越大自然在數十億年進化出的依靠病毒傳遞基因的效率。因此,優化非病毒轉染性能的最佳方法是盡可能模仿病毒轉運DNA的自然機制的試劑。

        西美杰代理的Mirus轉染試劑就是利用自然基因傳遞機制作為其化合物庫的設計靈感,從中篩選適合病毒生產的混合配方,將轉染試劑與核酸的靜電相互作用、細胞吸附與內吞、釋放、基因表達效率降低細胞毒性幾乎所有影響轉染成功率的因素全部考慮在內。通過不懈的努力,Mirus開發出了一種全新的仿生轉染技術——TransIT-VirusGEN系列轉染試劑,它不僅僅是基于PEI或脂質體,而是采用多組分脂質聚合物納米復合物(LPNC),能夠高效地結合和包裹DNA,將其帶入懸浮或貼壁的HEK293細胞中,然后將其從細胞核內釋放,以便同時滿足2-4個不同的質粒的表達,這種全新的轉染試劑比單獨使用PEI及其衍生聚合物或脂質體的轉染效率和完整病毒生產效率都有顯著提高。同時,Mirus還研發出了一種完全合成的(無動物源)轉染增強劑(Enhancer),與TransIT-VirusGEN轉染試劑搭配使用時,可以進一步提高病毒滴度。另外,為了滿足病毒載體從研發到大規模生產不同階段的需求,Mirus分別推出了R&D、SELECTGMP三種級別的TransIT-VirusGEN轉染系列產品,以適應不同階段病毒載體的生產規模、效率以及法規要求。

        實驗表明,Mirus基于LPNC的轉染試劑可以在不同的細胞培養平臺(貼壁和懸?。?/span>、生物反應器和培養基類型中提高病毒產量和功能性病毒滴度。與業內其他金標準相比,在使用增強劑的情況下,病毒滴度至少可提高2-4。而在加入增強劑之后,在合適的培養條件下,病毒產量甚至能夠提高10倍以上!(結果見下圖1-5

        1. 基于脂質聚合物納米復合物(LPNC)和聚乙烯亞胺(PEI配方的轉染試劑用于腺相關病毒(AAV)和慢病毒(LV)載體生產的性能對比。分別用基于LNPCTransIT-VirusGEN試劑(不含增強劑與含增強劑)、25kda PEI和基于PEI技術的競爭品牌A3轉染試劑產生AAV(左)和LV(右)。以LPNC為基礎的TransIT-VirusGEN轉染試劑比以PEI為基礎的轉染試劑的病毒顆粒表達量高3-5倍。當TransIT-VirusGEN和增強劑同時使用時,比單獨使用TransIT-VirusGEN大約提升了一倍。轉染試劑 : DNA的比值體積 : 質量。

         

        2. TransIT-VirusGEN轉染試劑在不同細胞培養基中的表現。使用Thermo Fisher Scientific公司的病毒生產細胞進行轉染,該細胞適應四種不同的培養基配方,分別來自Thermo Fisher公司的LV-MAX培養基、Expi293表達培養基、FreeStyle F17表達培養基和來自Irvine Scientific公司的BalanCD HEK293培養基。后一種培養基的AAV總效價較高,但在所有使用的培養基中,無論是否添加增強劑,TransIT-VirusGEN轉染試劑均表現優異。DNA與轉染試劑配比為2μg DNA 3μl轉染試劑,轉染細胞密度為2.0×106/ml。生產LV也獲得了類似的結果(數據未顯示)。

         

        3. 分別在四種不同的轉染條件和兩個不同的收獲時間,測定TransIT-VirusGEN轉染試劑和PEI為基礎的轉染試劑A3物理滴度和功能滴度。利用Expi293F細胞生產AAV2-GFP。轉染48小時和72小時后收獲的病毒分別測定功能滴度TU/mL(左)和物理滴度GC/mL(右)。結果顯示用TransIT-VirusGEN轉染試劑和增強劑轉染收獲病毒效價最高。此外,TransIT-VirusGEN轉染試劑PEI為基礎的轉染試劑的表達更快。這些結果表明,對于病毒滴度的評估,功能滴度可能是一個更可靠的指標。因此,建議測試幾個不同的收獲時間點確定最佳方案。

         

        4. 每種培養體系都應優化轉染細胞融合度和接種密度。用DMSO+10%胎牛血清培養貼壁的HEK293t/17細胞生產慢病毒g DNA/mL。試劑盒包括TransIT-VirusGEN轉染試劑、VirusGEN LV復合物形成溶液和VirusGEN LV增強劑。

         

        5. Expi293表達培養基中培養Expi293F細胞,使用VirusGEN AAV轉染試劑盒,內含TransIT-VirusGEN轉染試劑、VirusGEN AAV復合物形成溶液和VirusGEN AAV增強劑,在懸浮細胞培養中生產AAV。分別用2:1(左)和3:1(右)兩種比例來確定理想的轉染試劑和DNA配比(體積:質量)。每種轉染體系都應對轉染試劑: DNA配比及每毫升細胞所需的總DNA量進行優化。

         

        TransIT-VirusGEN轉染系列產品信息





        美國Mirus公司成立于1995年,是世界上很早開發高效、低毒轉染試劑的公司之一,同時也是目前該類試劑主要的供應商之一。Mirus被公認為轉染試劑開發的領跑者,其許多杰出成果獲得世界公認與廣大用戶的好評。

        北京西美杰科技有限公司是Mirus中國區代理,始終秉承著專業、嚴謹的態度為客戶提供優質的產品與服務。如果您對上述產品感興趣,歡迎致電北京西美杰客服熱線400-050-4006或登錄網站www.gadgetfanboy.com了解更多產品信息或申請試用。

         

        引用文獻:

        Addressing Critical Issues in Cell & Gene Therapy, Snow, J.

        https://www.mirusbio.com/assets/technical-documents/addressing-critical-issues-in-cell-gene-therapy.pdf

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